A prova do Enem 2026 incluiu uma série de referências culturais em suas questões. Logo na capa dos cadernos, os candidatos se depararam com um trecho da canção Maria, Maria, de Milton Nascimento, lançada em 1978. Cada versão do exame apresentou um verso diferente da composição, que precisava ser transcrito no cartão-resposta.

A música brasileira também apareceu por meio de Chico Buarque, lembrado por sua contribuição à literatura. Um trecho do livro Calabar: o Elogio da Traição, publicado em 2000 e escrito em parceria com Ruy Guerra, serviu de base para uma questão de interpretação. Já a composição O Bêbado e a Equilibrista, de João Bosco e Aldir Blanc, foi utilizada em uma pergunta sobre contexto histórico, com destaque para a gravação de Elis Regina.

O carimbó marcou presença com a paraense Dona Onete. A prova trouxe um texto sobre o álbum Banzeiro, de 2016, que também integrou o repertório de Daniela Mercury. A cantora baiana regravou uma das faixas do disco e ajudou a popularizá-la.

Nas artes plásticas, Candido Portinari foi citado com as pinturas Palhacinhos na Gangorra, de 1957, e Futebol, de 1935. O coletivo indígena Huni Kuin (MAHKU) apareceu por uma pintura feita na fachada do Pavilhão Central da Bienal de Veneza de 2024. A artista visual paraibana Iris Helena também teve uma obra incluída no exame e comemorou nas redes sociais: "Ainda sem acreditar que uma obra minha foi questão gigante no Enem! Gente, sério! Chorando de emoção aqui".

O cinema compareceu com o clássico O Grande Ditador, de 1940, dirigido por Charles Chaplin, em uma questão sobre análise ética. A dança foi representada pelo grupo Pulsar, companhia inclusiva que reúne bailarinos com e sem deficiência. O esporte teve a presença da bicampeã mundial Fabiana Murer em uma questão de interpretação textual. Na literatura, o romance 1984, de George Orwell, foi usado em um texto sobre a evolução da televisão e dos algoritmos. A prova também mencionou a releitura O Pequeno Príncipe Preto, lançada em 2020 pelo escritor e ex-BBB Rodrigo França, que adapta a história para valorizar a identidade negra.